Cos'è la coltura cellulare?
coltura cellulare
La coltura cellulare si riferisce al processo di crescita delle cellule in condizioni controllate al di fuori del loro ambiente naturale. È uno strumento in vitro che facilita la comprensione della biologia cellulare e dei meccanismi delle malattie. Svolge anche un ruolo nella scoperta di farmaci, come i test di tossicità dei farmaci e gli studi farmacocinetici/farmacodinamici, nonché la medicina personalizzata.
L'embriologo americano Ross Granville Harrison ha sviluppato le prime tecniche di coltura cellulare in vitro all'inizio del XX secolo, quando ha coltivato con successo frammenti di tessuto da embrioni di rana in vitro. Oggi, la coltura cellulare ha contribuito a innumerevoli scoperte, come lo sviluppo di vaccini contro la poliomielite, il morbillo, la parotite e altre malattie infettive.
Cultura di adesione e sospensione
Esistono due sistemi di base per la crescita cellulare: coltura aderente e coltura in sospensione. Le colture aderenti vengono coltivate su substrati artificiali, mentre le cellule in colture in sospensione galleggiano liberamente nel terreno. Mentre solo pochi tipi di cellule crescono naturalmente in sospensione (ad esempio i linfociti), molti tipi di cellule aderenti possono essere adattati alla coltura in sospensione.
Ci sono due ragioni per coltivare cellule naturalmente aderenti in sospensione. Il primo vantaggio della coltura in sospensione è che le cellule sono più facili da passare perché non è necessario dissociarle enzimaticamente o meccanicamente dal recipiente di coltura. In secondo luogo, le colture in sospensione sono più facili da aumentare perché la crescita cellulare è limitata solo dalla loro concentrazione nel mezzo, non dalla superficie disponibile. Il principale svantaggio delle colture in sospensione è che richiedono conta cellulare giornaliera e analisi di vitalità per seguire i modelli di crescita, mentre le colture aderenti possono essere facilmente esaminate al microscopio.
Metodi 2D e 3D
Le culture aderenti possono essere ulteriormente suddivise in culture 2D e 3D. Nelle applicazioni 2D, le cellule aderenti vengono coltivate in un sistema monostrato su una superficie piana, come in un pallone di coltura cellulare.
coltura cellulare
Grazie alla sua semplicità, la tecnologia 2D non può imitare l'ambiente in vivo delle cellule, che tipicamente crescono in strutture tridimensionali con complesse interazioni cellula-cellula. Questo è il motivo per cui alcuni esperimenti vengono eseguiti utilizzando colture 3D che possono essere coltivate utilizzando tecnologie basate su scaffold o senza scaffold.
I metodi 3D basati su impalcature in genere comportano la crescita di cellule aderenti in impalcature di idrogel. Per alcune applicazioni vengono utilizzate anche alternative come scaffold in bioceramica, metallo o polimero.
Le tecniche senza scaffold vengono utilizzate per far crescere gli sferoidi con uno dei tre diversi metodi:
Float forzato: caricare la sospensione cellulare nei pozzetti di una micropiastra rivestita di polimero a bassa aderenza. La micropiastra viene quindi centrifugata per forzare le cellule a formare sferoidi.
Goccia sospesa: la sospensione cellulare viene caricata nei pozzetti di una piastra di caduta sospesa. Come suggerisce il nome, la sospensione si bloccherà sul piatto sotto forma di goccioline. Le cellule si aggregheranno sulle punte di queste goccioline e formeranno delle sfere.
Basato sull'agitazione: la sospensione cellulare viene posta in un bioreattore rotante. A causa della costante agitazione, le cellule non riuscivano ad aderire alle pareti, formando così degli sferoidi.
Sfida della coltura cellulare
Nonostante le differenze nei metodi e nelle tecniche, tutti gli esperimenti hanno una cosa in comune: è difficile far crescere cellule vive nel numero richiesto per ottenere risultati riproducibili. Pertanto, le sezioni seguenti saranno dedicate a quattro sfide: ripetibilità, contaminazione, fattibilità e transizione all'automazione.
riproducibilità
Secondo un sondaggio di Yongyue Medical, oltre il 70% degli scienziati ha riferito di non essere riuscito a riprodurre gli esperimenti di un altro scienziato e più della metà non è riuscita a riprodurre il proprio lavoro. Nei saggi di coltura cellulare, la maggior parte dei problemi di riproducibilità derivano da differenze biologiche tra passaggi o generazioni cellulari. Un altro grosso problema è l'errata identificazione delle linee cellulari e anche le incoerenze nei parametri di coltura giocano un ruolo importante.
variazione biologica
Fattori come mutazioni casuali o errori di trascrizione possono potenzialmente influenzare la riproducibilità degli esperimenti ogni volta che una cellula si divide. Per evitare ciò, è necessario creare una banca di celle all'inizio di un nuovo progetto.
banca cellulare
La banca cellulare si riferisce al processo di archiviazione di lotti di tipi di cellule specifici per un uso successivo per evitare fattori come mutazioni casuali o errori di trascrizione che influiscono sulla riproducibilità. Il primo passo è stabilire una banca cellulare principale (MBC) coltivando tipi di cellule selezionati di interesse per la coltura e crioconservandoli in più contenitori. I lotti di MBC vengono scongelati e utilizzati successivamente per preparare banche cellulari funzionanti (WBC).
Errata identificazione delle linee cellulari
Il problema dell'errata identificazione delle linee cellulari è noto sin dagli anni '60, quando uno scienziato descrisse la contaminazione cellulare HeLa di altre 19 linee cellulari umane. Per assicurarti che i tuoi risultati siano affidabili e, cosa più importante, che tu non tragga false conclusioni, dovresti mettere in quarantena tutte le nuove linee cellulari che entrano nel laboratorio fino a quando la loro origine non è stata verificata. Ancora più importante, si raccomanda di ripetere la qualificazione della linea cellulare prima della crioconservazione e della distribuzione ad altri laboratori e dopo il completamento del progetto. Per verificare una linea cellulare, dovresti prima verificare se è elencata nel registro delle linee cellulari identificate erroneamente. Se non è registrato, è comunque necessario confermarne l'autenticità. Per le linee cellulari umane, si raccomanda l'analisi STR (short tandem repeat) (DNA fingerprinting). È disponibile una varietà di metodi di test per le linee cellulari non umane, tra cui cariotipizzazione, analisi degli isoenzimi e tipizzazione del DNA mitocondriale (codici a barre del DNA).
Parametri colturali
Un terzo fattore che influenza la riproducibilità sono i parametri di coltura.
Ad esempio, i livelli di ossigeno possono influenzare in modo significativo le cellule in coltura. Tuttavia, le variabili che influenzano l'ossigenazione, come le dimensioni della camera o la densità cellulare, non sono sempre documentate e pertanto non possono essere mantenute coerenti.
Un altro importante parametro culturale è il mezzo. Questo fornisce nutrienti essenziali, fattori di crescita e ormoni e regola il pH e la pressione osmotica. Pertanto, la cosa più importante è che la sua composizione sia sempre la stessa. Ciò è particolarmente critico per le formulazioni medie integrate con siero bovino fetale (FBS), la cui composizione dipende da fattori quali la dieta della vacca, la posizione geografica e il periodo dell'anno. Per ridurre al minimo l'effetto di FBS sulla riproducibilità dei risultati, è necessario ordinare diversi lotti di siero quando le scorte attuali iniziano a scarseggiare e testarle per trovare la corrispondenza più vicina. Affinché altri possano riprodurre i risultati, è necessario segnalare come è stato eseguito lo screening del siero e registrare il numero di lotto.
coltura cellulare
Elaborazione cellulare
La maggior parte dei ricercatori sa che i parametri di coltura hanno un enorme impatto sulle loro applicazioni, ma i cambiamenti nelle tecniche di elaborazione sono spesso trascurati.
Inquinamento
Quando le cellule vengono isolate dal tessuto e coltivate in laboratorio, non sono più protette dal sistema immunitario e sono quindi estremamente vulnerabili alla contaminazione.
La prima fonte di contaminazione sono i contaminanti abiotici come le impurità nel terreno di coltura, nel siero, negli integratori o nell'acqua, nonché le endotossine e le sostanze rilasciabili. Le precauzioni includono l'uso di acqua da laboratorio per esperimenti di coltura cellulare e terreni, siero, integratori e materiali di consumo di produttori che offrono la certificazione del test delle endotossine. Inoltre, i materiali di consumo devono essere realizzati in polistirene vergine o polipropilene per garantire che gli additivi plastici non penetrino nella coltura cellulare.
La seconda fonte di contaminazione sono i contaminanti biologici come batteri (compreso il micoplasma), funghi e lieviti.
fattibilità
La vitalità cellulare è definita come la proporzione di cellule vitali in un campione. Oltre ai contaminanti che abbiamo appena visto, ci sono vari altri fattori che influenzano la vitalità cellulare. Le condizioni ambientali - temperatura, pH, pressione osmotica, disponibilità di nutrienti e concentrazioni di O2 e CO2 - sono molto importanti. La maggior parte di queste variabili sono controllate dal mezzo e sono specifiche del tipo di cellula, il che purtroppo significa che non possiamo fornire linee guida specifiche.
Poiché le celle sono molto sensibili alla pressione, è necessario prestare attenzione non solo alle condizioni ambientali, ma anche alle tecniche di gestione dei liquidi.
Un ultimo fattore che influenza la vitalità cellulare è la senescenza. La maggior parte delle linee cellulari finite sopravvive da 20 a 60 divisioni prima di morire, il che significa che possono essere riutilizzate solo tra 15 e 45 generazioni. Successivamente, il campione crioconservato deve essere scongelato dalla banca cellulare. Le linee cellulari continue possono proliferare indefinitamente, ma poiché sono soggette a deriva genetica, dovrebbero essere sostituite regolarmente.
I test di rilevamento che utilizzano metodi colorimetrici, fluorometrici e bioluminescenti possono essere utilizzati per misurare la vitalità cellulare. Un metodo colorimetrico comunemente usato è il metodo MTT, che si basa sulla riduzione dei sali di tetrazolio giallo a cristalli di formazano viola da parte delle cellule viventi.
96-pozzetti
automazione
Molte delle sfide sopra descritte possono essere affrontate automatizzando i flussi di lavoro delle colture cellulari. Ad esempio, la gestione delle cellule sarà sempre coerente, con un impatto positivo sulla riproducibilità e la redditività. Soprattutto, l'automazione riduce il rischio di contaminazione da parte dell'utente.
Nonostante questi vantaggi, l'automazione di interi flussi di lavoro può essere difficile per motivi di budget, mancanza di spazio per i robot o perché non ci sono risorse sufficienti per automatizzare e convalidare ogni passaggio in una volta. Ma questo può essere risolto!
