Nell'era post-epidemia, il termine "test dell'acido nucleico" è familiare a tutti noi ed è diventato parte della nostra vita quotidiana.
Allora, sai come i test sugli acidi nucleici rilevano i virus? E in che modo i test sugli acidi nucleici rendono "visibili" i virus invisibili?
01 Cos'è l'acido nucleico
L'acido nucleico è il termine generale per DNA e RNA.
L'acido nucleico è un componente essenziale di tutta la vita conosciuta sulla terra. Il DNA che spesso diciamo è acido desossiribonucleico. Il materiale genetico del nuovo coronavirus è l'RNA - acido ribonucleico.
Test di amplificazione degli acidi nucleici
02 Che cosa rileva esattamente il test degli acidi nucleici?
La sostanza per il rilevamento dell'acido nucleico è l'acido nucleico del virus.
Il nuovo coronavirus è un virus che contiene solo RNA e la specifica sequenza di RNA nel virus è un marcatore che distingue il virus da altri agenti patogeni. Il rilevamento dell'acido nucleico serve a scoprire se è presente acido nucleico di virus invasore estraneo nel campione respiratorio o nel sangue del paziente per determinare se è stato infettato dal nuovo coronavirus. La stragrande maggioranza dell'attuale rilevamento dell'acido nucleico del nuovo coronavirus utilizza il metodo PCR quantitativo fluorescente per amplificare la sequenza bersaglio dell'RNA virale mediante PCR dopo la trascrizione inversa.
La PCR, o reazione a catena della polimerasi, è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare specifici frammenti di DNA; si riferisce alla reazione catalizzata dalla DNA polimerasi di geni specifici o La reazione di rapida amplificazione in vitro di sequenze di DNA è anche chiamata amplificazione genica in vitro. La tecnologia PCR quantitativa fluorescente consiste nell'aggiungere un sistema reporter fluorescente al sistema di reazione PCR e utilizzare il cambiamento del segnale fluorescente per monitorare il processo PCR in tempo reale, in modo da realizzare il rilevamento quantitativo del modello iniziale.
Per rilevare l'acido nucleico, il primo passo è raccogliere un campione. Attualmente, il metodo di campionamento più convenzionale è: utilizzare tamponi faringei o tamponi nasali per pulire e prelevare il tratto respiratorio superiore (faringe o cavità nasale); i campioni raccolti verranno rigorosamente sigillati, e poi inviati al laboratorio per il graduale controllo.
1. Estrazione dell'RNA virale
L'RNA del virus viene prima estratto dal campione. Aggiungere i reagenti di estrazione dell'acido nucleico al campione per distruggere il virus e rilasciare l'acido nucleico.
2. "Trascrizione inversa" dell'RNA virale in cDNA
Attraverso la tecnologia della trascrizione inversa (RT), l'RNA del virus viene "invertito" in un DNA specifico più conveniente da rilevare, ovvero il cDNA.
3. Amplificazione e rilevazione del cDNA
Infatti, che si tratti di tampone faringeo, tampone nasale o addirittura prelievo di sangue, il contenuto virale nel campione è relativamente basso, anche nei pazienti gravemente infetti (la carica virale è elevata); poiché le particelle virali sono troppo piccole e il volume di campionamento è limitato, il numero di virus contenuti nel campione è ancora troppo piccolo per il rilevamento dell'acido nucleico.
Pertanto, utilizzando la tecnologia PCR, gli ispettori amplificano la "password" univoca del nuovo coronavirus nel campione fino al punto in cui l'apparecchiatura può rilevarla, in modo da giudicare se si tratta di un'infezione positiva. L'intero processo di cattura del materiale genetico del virus è come la pesca. Il gancio lo identificherà e lo afferrerà, in modo che il virus non abbia nessun posto dove nascondersi.
In poche parole, è per amplificare il numero di cDNA, in modo che il cDNA venga continuamente replicato, in modo che il numero aumenti in modo esponenziale.
Il processo PCR standard è suddiviso in tre fasi:
Denaturazione: l'uso di alte temperature per separare i doppi filamenti di DNA. I legami idrogeno tra i doppi filamenti del DNA si rompono ad alta temperatura (93 - 98 gradi).
Ricottura: dopo che i doppi filamenti di DNA si sono separati, la temperatura viene abbassata per consentire ai primer di legarsi al DNA a singolo filamento.
Estensione: la DNA polimerasi sintetizza un filamento complementare lungo il filamento di DNA dal primer legato quando la temperatura viene abbassata. Quando l'allungamento è completo, un ciclo è completato e il numero di frammenti di DNA raddoppia. Ripeti questi tre passaggi 25-35 volte e il numero di frammenti di DNA aumenterà in modo esponenziale.
Modello PCR a doppio filamento
Mentre il cDNA viene amplificato, le sonde fluorescenti nel kit lavorano simultaneamente. Rilascerà un segnale fluorescente e ogni volta che il cDNA viene amplificato, il segnale fluorescente aumenterà leggermente e il rilevatore PCR può registrare un valore Ct di un aumento del segnale fluorescente.
Il valore Ct è un indicatore importante per giudicare se l'acido nucleico del virus è negativo o positivo. Meno DNA iniziale, più cicli di PCR sono necessari per raggiungere una certa soglia e più alto è il valore Ct. Al contrario, maggiore è il DNA iniziale, minore è il valore Ct. La quantità iniziale di DNA riflette la quantità di RNA virale nel campione, che a sua volta riflette la quantità di virus nel campione. Pertanto, se il valore Ct non viene rilevato o è superiore a un certo valore, allora il paziente sospetto viene giudicato negativo; se è inferiore a questo valore, il paziente sospetto viene giudicato positivo.
Durante la reazione PCR, la selezione dei consumabili PCR è anche uno dei fattori più importanti che influenzano i risultati del rilevamento dell'acido nucleico.
