Quando ti sei appena laureato e sei entrato nel lavoro, ti trovi di fronte a un mucchio di sostantivi che affrontano esperimenti PCR quantitativi in tempo reale. Sei confuso su dove cominciare? Qual è il significato di curva di amplificazione, curva standard, soglia, valore CT, curva di fusione e linea di base? Le immagini fluorescenti di quegli esperimenti sono troppo luminose, ma non riesco a identificarle. Oggi ti porteremo ad apprendere queste conoscenze e concetti in due parti: termini tecnici e domande frequenti.
Parte I Termini professionali
1. Curva di amplificazione
La curva di amplificazione si riferisce alla curva in cui il numero del ciclo è l'ascissa e l'intensità della fluorescenza in tempo reale durante la reazione è l'ordinata durante la PCR.
2. Linea di base
La linea di base si riferisce a piccoli cambiamenti nel segnale fluorescente durante i primi cicli di una reazione di amplificazione PCR. Il livello del segnale mostra vicino a una linea retta, che è la linea di base.
3. Impostazione della soglia di fluorescenza
In genere, il segnale di fluorescenza dei primi 15 cicli della reazione PCR viene utilizzato come segnale di fondo della fluorescenza e la soglia di fluorescenza è 10 volte la deviazione standard del segnale di fluorescenza durante 3-15 cicli di PCR e la soglia di fluorescenza viene impostato durante la fase esponenziale dell'amplificazione PCR. Tipicamente, ogni strumento ha la sua soglia di fluorescenza prima dell'uso.
4. Valore TA
Il valore CT rappresenta il numero di cicli che si verificheranno per ciascuna provetta di reazione PCR quando il segnale fluorescente raggiunge la soglia impostata. Dalla ricerca, sappiamo che esiste una relazione lineare tra il valore CT di ciascun modello e il logaritmo del numero di copie iniziale di quel modello. Maggiore è il numero di copie iniziali, minore è il valore CT e viceversa. Utilizzando standard con numero di copie iniziale noto, è possibile creare una curva di calibrazione in cui l'ascissa rappresenta il logaritmo del numero di copie iniziale, mentre l'ordinata rappresenta il valore CT. Pertanto, fintanto che si ottiene il valore CT del campione sconosciuto, il numero di copie iniziale del campione può essere calcolato dalla curva standard.
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Esistono diversi indicatori per giudicare se la curva di amplificazione è buona o meno:
Risposta: il punto di flesso della curva è evidente, in particolare la fase esponenziale del campione della frazione basso-pesante è evidente, il parallelismo complessivo della curva di amplificazione è molto buono, la linea di base è piatta, non vi è alcun fenomeno di aumento e l'amplificazione la curva del campione di concentrazione di fase esponenziale di basso livello è molto buona. ovvio.
B: La pendenza della fase esponenziale della curva è direttamente proporzionale all'efficienza di amplificazione, maggiore è la pendenza, maggiore è l'efficienza di amplificazione.
C: La linea di base standard è piatta o leggermente in calo, senza apparente tendenza al rialzo.
D: Il parallelismo delle curve di amplificazione per ciascuna provetta è buono, indicando che l'efficienza di amplificazione di ciascuna provetta di reazione è simile.
5. Curva di fusione
Quando il prodotto di PCR viene riscaldato, all'aumentare della temperatura, il prodotto di amplificazione a doppio filamento si dissocia gradualmente, determinando una diminuzione dell'intensità della fluorescenza. Quando viene raggiunta una certa temperatura, una grande quantità di prodotto si separa, determinando una netta diminuzione della fluorescenza. L'utilizzo di questa funzione insieme a diversi valori TM per diversi prodotti PCR differisce anche nella temperatura alla quale il segnale fluorescente diminuisce rapidamente, il che può essere un buon modo per identificare la specificità della PCR.
6. Curva di fusione (utilizzando la curva logaritmica)
Il grafico del picco è formato dal logaritmo della curva di fusione per visualizzare in modo più intuitivo la situazione dei frammenti di prodotto. Poiché la temperatura di fusione è il valore TM di un frammento di DNA, è possibile determinare alcuni parametri che influenzano il valore TM di un frammento di DNA, come la dimensione del frammento, il contenuto di GC, ecc. In generale, secondo il nostro principio di progettazione del primer, di solito si dice che la lunghezza del prodotto amplificato sia nell'intervallo di 80-300bp e che la temperatura di fusione sia compresa tra 80 e 90 gradi .
R: Se c'è solo un picco principale tra 80 gradi e 90 gradi, significa che la PCR in tempo reale è perfetta.
B: Se il picco principale appare tra 80 gradi e 90 gradi e il picco di impurità appare al di sotto di 80 gradi, il primer-dimero è fondamentalmente considerato. Questa è una buona opzione da provare a risolvere aumentando la temperatura di ricottura.
C: Se il picco principale appare tra 80 gradi e 90 gradi, e un picco errante appare quando la temperatura aumenta, la contaminazione del DNA è fondamentalmente considerata. E il DNA deve essere rimosso nelle fasi iniziali dell'esperimento.
7. Linea curva standard
Gli standard standard sono stati diluiti a diverse concentrazioni e utilizzati come modelli per le reazioni di PCR. La curva standard viene tracciata con il logaritmo del numero di copie standard come ascissa e il valore CT misurato come ordinata. Quando si quantifica un campione sconosciuto, il numero di copie del campione può essere ottenuto dalla curva standard basata sul valore CT del campione sconosciuto. Le curve standard sono molto importanti per la quantificazione assoluta.
la seconda parte. problema comune
D1: Qual è la differenza tra RT-PCR, QPCR, PCR in tempo reale e RT-PCR in tempo reale?
A1: RT-PCR è la PCR a trascrizione inversa, che è una variante ampiamente utilizzata della reazione a catena della polimerasi. In RT-PCR, il filamento di RNA viene retrotrascritto in DNA complementare, che viene quindi utilizzato come stampo per PCR per amplificare il DNA mediante PCR.
La PCR in tempo reale e la QPCR sono la stessa cosa, entrambe sono PCR quantitativa in tempo reale, il che significa che c'è una registrazione in tempo reale dei dati ad ogni ciclo durante il processo di PCR. In questo modo è possibile analizzare con precisione il numero di modelli di avvio.
Sebbene sia la PCR in tempo reale che la PCR a trascrizione inversa sembrino essere abbreviate in RT-PCR, la convenzione internazionale è che RT-PCR si riferisce specificamente alla PCR a trascrizione inversa, mentre la PCR in tempo reale è spesso abbreviata in qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - tempo PCR).
La RT-PCR in tempo reale (RT-QPCR) è un tipo di PCR a trascrizione inversa che combina tecniche quantitative fluorescenti: prima trascrizione inversa dall'RNA per ottenere cDNA (RT), seguita da analisi quantitativa mediante PCR in tempo reale (QPCR).
D2: Perché la lunghezza del frammento del prodotto amplificato della PCR quantitativa fluorescente è controllata all'interno dell'intervallo di 80-300 bp?
A2: La lunghezza di ciascuna sequenza genica è diversa, alcune di esse sono diverse Kb e centinaia di BP. Tuttavia, quando progettiamo il primer, dobbiamo solo richiedere che la lunghezza del prodotto sia 80-300bp, e troppo corto o troppo lungo non è adatto per il rilevamento PCR quantitativo.
I frammenti di prodotto sono troppo corti per essere distinti dai primer-dimeri. La lunghezza del primer-dimero è di circa 30-40bp, quando è inferiore a 80bp, è difficile distinguere se si tratta di un primer-dimero o di un prodotto. Se il frammento del prodotto è troppo lungo, superiore a 300 bp, porterà facilmente a una bassa efficienza di amplificazione e la quantità di gene non può essere rilevata in modo efficace.
Ad esempio, quando conti il numero di persone in una classe, devi solo contare quante bocche ci sono. Lo stesso vale quando si testano i geni. Hai solo bisogno di rilevare una certa sequenza di un gene per rappresentare l'intera sequenza. È facile commettere un errore se conti sia la bocca che il naso, le orecchie e gli occhiali per contare le persone.
D3: Qual è la lunghezza ottimale per il design del primer?
A3: In generale, le lunghezze dei primer nell'intervallo di 20-24 bp sono buone. Naturalmente, dobbiamo prestare attenzione al valore TM del primer durante la progettazione del primer, poiché è correlato alla temperatura di ricottura ottimale. Dopo molti esperimenti, è stato dimostrato che 60 gradi è un buon valore TM. Una bassa temperatura di ricottura può facilmente portare a un'amplificazione non specifica, mentre un'elevata temperatura di ricottura di solito porta a una bassa efficienza di amplificazione, un picco tardivo della curva di amplificazione e un valore CT ritardato.
Domanda 4: La quantità di campione raccolto influisce sui risultati sperimentali?
R4: No. Ovviamente, più campioni vengono raccolti, più RNA viene estratto, più cDNA e più frammenti bersaglio ci saranno. Per la quantificazione assoluta, è necessario calcolare il numero di copie del frammento target e la quantità di campione raccolto influenzerà sicuramente i risultati sperimentali. Ad esempio, il rilevamento del virus dell'epatite C HBV nel sangue consiste nel rilevare il contenuto di HBV in una certa quantità (1 ml) di sangue.
Per la quantificazione relativa comunemente utilizzata nella ricerca scientifica, il numero di campioni non ha nulla a che fare con i risultati sperimentali, perché la quantificazione relativa si riferisce al confronto tra il gene bersaglio e il gene di riferimento. Considerali semplicemente come frammenti a monte ea valle presenti nello stesso filamento di acido nucleico. Se la dimensione del campione è grande, entrambi i geni di riferimento e bersaglio vengono aumentati in proporzioni uguali allo stesso tempo, il che non influisce sui risultati.
D5: L'efficienza della trascrittasi inversa influirà sui risultati sperimentali?
A5: Come sopra. Si noti che vogliamo una maggiore efficienza RT, ma preferiamo che l'enzima RT sia relativamente stabile e ottenga risultati uniformi. Questo sarà un test delle capacità ottimizzate delle suite di trascrizione inversa delle principali aziende.
Domanda 6: L'efficienza dell'enzima TAQ influisce sui risultati sperimentali?
A6: L'efficienza dell'enzima TAQ è relativamente grande. In genere, sono necessari enzimi taq hot-start e sono relativamente efficienti. Per i kit quantitativi commerciali di fluorescenza, ogni produttore ottimizzerà l'efficienza dello stato migliore in base ai propri prodotti vicino al 100 percento, se l'efficienza è troppo bassa, non è possibile ottenere i risultati sperimentali. Per i prodotti di diverse aziende, questa è una misura della qualità.
Domanda 7: La quantità di colorante fluorescente influisce sui risultati sperimentali?
A7: Sì, lo farà. Se il fluorocromo è troppo saturo, può causare interferenze di rumore in alcuni strumenti. Se il fluorocromo non è saturo e il valore di fluorescenza è troppo basso, entrerà presto in una fase di plateau e la curva di amplificazione sarà piatta. Nell'esperimento quantitativo di fluorescenza, si vede principalmente il valore CT, quindi non è importante che la curva di amplificazione tardiva entri nella fase di plateau, ma l'immagine non è abbastanza bella. Se dovessi scegliere, inizia scegliendo un fluorocromo leggermente meno saturo. Tuttavia, quando si utilizza lo stesso prodotto della stessa azienda, il suo effetto è sostanzialmente trascurabile.
Domanda 8: La trasmissione della provetta PCR influirà sui risultati sperimentali?
R8: Sì. Tuttavia, per lo stesso lotto di materiali di consumo dello stesso produttore, questo effetto può essere ignorato. Questa è una buona scelta ed è meglio utilizzare una 96-piastra a pozzetti con una membrana ad alta permeabilità per ridurre al minimo l'effetto della trasmissione della luce dei materiali di consumo.
D9: Gli errori durante il funzionamento influiranno sui risultati sperimentali?
A9: L'influenza del processo operativo si riflette principalmente nell'uniformità. Omogeneità significa che tutti i componenti del sistema sono miscelati uniformemente insieme e la centrifugazione flash può risolvere questo problema. Inoltre, per i principianti, è meglio regolare il sistema PCR in modo che sia più di 20 pollici e un sistema troppo piccolo è più soggetto a errori. Se la temperatura di ricottura è ottimizzata correttamente, l'effetto della concentrazione del primer su CT è ridotto al minimo. E saprai che alcuni errori operativi (come la concentrazione del primer) possono essere evitati ottimizzando la temperatura di ricottura.
Riassumere
Quanto sopra sono alcune domande e domande che i novizi incontrano spesso durante l'esperimento, speriamo che queste domande possano aiutarti a risolvere un po' di confusione. La sperimentazione è il processo di generazione del caos e risoluzione dei problemi, si spera che tu ne tragga qualcosa. Grazie per aver letto e alla prossima!