Per le comuni capsule di Petri con fondo di vetro sul mercato, di solito viene praticato un foro sul fondo di una capsula di Petri di plastica, quindi un vetro di copertura o un vetrino con uno spessore di 170-220 μm viene incollato sul fondo della capsula di Petri con colla senza ombre o gel di silice. Non tutto il fondo della capsula di Petri è di vetro. L'area adatta all'osservazione è solo nell'area della perforazione. Tuttavia, a causa dell'idrofobicità del vetro, durante la coltura delle cellule, le cellule non possono aderire bene al vetro e lo stato di crescita non è buono e anche il fenomeno della delaminazione cellulare si verifica durante l'imaging a scansione confocale.
Affinché le cellule aderiscano bene, è necessario confermare che specifici reagenti proteici siano stati rivestiti prima di utilizzare piatti con fondo di vetro per la coltura cellulare.
trapunta fai da te
Diverse colture cellulari richiedono diversi reagenti di rivestimento. Allo stesso tempo, poiché la proteina utilizzata per il rivestimento è un prodotto biologico, la purezza del prodotto e il dosaggio della proteina di rivestimento di diverse aziende sono diversi. Questo post tecnico è solo per riferimento. Il dosaggio specifico dei reagenti di rivestimento deve fare riferimento alle istruzioni dei marchi utilizzati. . Ed è meglio fare un esperimento di gradiente con i reagenti che usi per trovare la concentrazione di rivestimento più adatta.
Ecco un esempio di Poly-L-Lisina (PLL, sigma, P4832, 100ug/ml):
Il rivestimento PLL è adatto per la stragrande maggioranza delle cellule, in particolare per la coltura dei neuroni nel sistema centrale. È necessario fare in modo che il contenuto proteico (ug/cm2) per unità di area raggiunga la quantità desiderata durante l'uso. La quantità consigliata di rivestimento per PLL in questo esempio è di 2 ug/cm2. È necessario calcolare la quantità di proteine necessarie in base all'area di rivestimento e al volume di rivestimento.
Ad esempio: capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm, l'area di crescita cellulare è di 3,5 cm2, l'area di rivestimento è di 4,1 cm2 e il volume della soluzione di rivestimento è di 400 ul, quindi il dosaggio raccomandato è di 2 ug/cm2. Quindi sono necessari 8,2 ug di PLL in un singolo pozzetto. Se si aggiungono solo 400 ul di soluzione PLL, la concentrazione della soluzione PLL è di 20,5 ug/ml (circa 20 ug/ml). Pertanto, la soluzione madre deve essere diluita con acqua ultrapura.
Passaggi specifici:
1. Diluire la soluzione madre PLL 1:5 con acqua ultrapura.
2. Aggiungere 400 ul di diluizione PLL a ciascuna piastra di Petri con fondo in vetro da 35 mm.
3. Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente e aspirare la diluizione PLL.
4. Lavare accuratamente 3 volte con 2 ml di soluzione PBS o terreno privo di siero e aspirare la soluzione di lavaggio.
5. Aggiungere direttamente la sospensione cellulare per la coltivazione.
Valutazione del metodo
A causa delle diverse proprietà delle varie proteine di rivestimento, diverse proteine di rivestimento vengono utilizzate in modi diversi. Spesso si creano nuove contaminazioni a causa della necessità di rivestire piatti con fondo di vetro. Inoltre, la contaminazione viene spesso scoperta dopo che le celle sono state sollevate, il che non solo ritarda i tempi, ma fa anche sprecare i materiali di consumo del kit. Dopotutto, i reagenti proteici rivestiti e i piatti con fondo di vetro di qualità garantita sono costosi (i piatti con fondo di vetro di scarsa qualità possono perdere perché la colla non è appiccicosa o la colla utilizzata è tossica per le cellule).
Piastre Petri confocali senza rivestimento
Per i bambini che vogliono risparmiare tempo e fatica, è più conveniente utilizzare piatti di coltura confocale senza rivestimento.
I fattori da considerare quando si sceglie un piatto di coltura adatto sono: se è adatto alle proprie cellule a cui aderire, se le caratteristiche ottiche del piatto di coltura soddisfano i requisiti confocali.
Le piastre Petri che soddisfano i requisiti dei suddetti fattori non sono limitate alle piastre con fondo in vetro rivestito. In effetti, tutti sanno che i piatti di plastica sono più economici e più facili da aderire alle cellule rispetto al vetro. Ecco un esempio di un piatto di coltura confocale di Shanghai Jingan, per parlare dei parametri che deve avere un piatto di coltura adatto per esperimenti confocali:
Si può vedere che i parametri fisici dei piatti di coltura confocale che soddisfano i requisiti dell'uso diretto sono molto vicini al vetro, ma allo stesso tempo hanno anche proprietà idrofile, che possono far aderire meglio la maggior parte delle cellule; e la duttilità sono migliori del vetro. Consente alla maggior parte delle linee cellulari e delle cellule primarie di aderire direttamente al muro e non è fragile, il che è una buona scelta.
Puoi anche trovare il piatto di coltura confocale più adatto per il tuo esperimento in base alle tue specifiche esigenze sperimentali e ai parametri nella tabella sopra.
Valutazione del metodo
La scelta di questo tipo di capsula di Petri non richiede un rivestimento aggiuntivo, riducendo notevolmente il rischio di contaminazione. E poiché il fondo in plastica è più facile da lavorare, non è necessaria alcuna colla per fissarlo al fondo della capsula di Petri. Eliminare la possibilità di perdite o citotossicità.