Dobbiamo lavare il kit PCR a otto tubi dopo l'uso. Esistono alcuni modi per pulire il kit ottavi PCR. A cosa devo prestare attenzione quando lo uso?
Principio del metodo sperimentale: la membrana di gel di silice si lega al DNA in condizioni ad alto contenuto di sale e si separa dal DNA in condizioni a basso contenuto di sale. Primer, mononucleotidi, enzimi, olio minerale, ioni salini, ecc. sono separati nella soluzione di lavaggio contenente DNA in quanto non hanno proprietà simili al DNA.
Materiali sperimentali: prodotti PCR, reagenti, kit, kit di pulizia PCR, strumenti, materiali di consumo, piastre di preparazione del DNA a 96 pozzetti, piastre a pozzo profondo a 96 pozzetti, piastre a forma di V a 96 pozzetti
1. Il produttore di otto tubi PCR parla della composizione, della conservazione e della stabilità del kit
1. Istruzioni, materiali di consumo: piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti, piastra profonda da 96 pozzetti da 1,6 ml, piastra a forma di V da 96 pozzetti.
2. Buffer PCR-A: soluzione legante il DNA. Conservare ben chiuso a temperatura ambiente. Se si verifica una precipitazione, deve essere sciolto in un bagno caldo a 65 ° C e raffreddato a temperatura ambiente prima dell'uso.
3. Tampone W2 concentrato: rimuovere la soluzione salina. Prima dell'uso, aggiungere etanolo al volume specificato sulla bottiglia, mescolare bene e conservare a temperatura ambiente. È possibile utilizzare etanolo al 100% o etanolo assoluto al 95%.
4. Eluente: 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,5, conservato in uno stato sigillato a temperatura ambiente.
2. Il produttore di tubi PCR a otto accoppiati parla delle fasi operative
Gli utenti possono scegliere la pressione negativa o la centrifugazione.
A. Metodo della pressione negativa
1. Collegare correttamente il dispositivo a pressione negativa, posizionare la piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti sul dispositivo a pressione negativa; aggiungere 3 volte la PCR-A tampone alla PCR, alla digestione enzimatica, all'etichettatura enzimatica o alla soluzione di reazione di sequenziamento (se il tampone PCR-A è inferiore a 100 μl, aggiungere 100 μl); mescolare bene e trasferire su una piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti, accendere e regolare la pressione negativa a -25-30 pollici Hg e aspirare lentamente la soluzione nella piastra.
2. Aggiungere 0,3 ml di tampone W2 e assorbire la soluzione. Lavare due volte con 0,3 ml di tampone W2 nello stesso modo.
Confermare l'aggiunta di etanolo assoluto al volume indicato di buffer W2 concentrato sul flacone del reagente.
3. Mantenere la pressione negativa ed estrarre la piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti per 10 minuti.
4. Macinare la piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti 6 volte sul tessuto fibroso lungo con il tubo di drenaggio rivolto verso il basso.
5. Posizionare la piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti su una piastra a forma di V a 96 pozzetti, aggiungere 25-30ul di acqua o eluire al centro della membrana e lasciare riposare per 1 minuto a temperatura ambiente. Il DNA è stato eluito mediante centrifugazione a 3 000 x g per 5 minuti.
B. Centrifuga
1. Aggiungere 3 volumi di Buffer PCR-A (se Buffer PCR-A è inferiore a 100 μl, aggiungere 100 μl) a PCR, digestione, etichettatura enzimatica o reazioni di sequenziamento; mescolare e trasferire al DNA a 96 pozzetti in una piastra di preparazione a 96 pozzetti. Posizionare la piastra di preparazione del DNA in una piastra profonda 96 pozzetti da 1,6 ml, centrifugare a 1000 x g per 1 minuto ed eliminare il filtrato.
2. In una piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti, aggiungere 0,3 ml di tampone W2, centrifugare a 1000 × g per 1 minuto ed eliminare il filtrato. Lavare di nuovo nello stesso modo con 0,3 ml di tampone W2. Confermare l'aggiunta di etanolo assoluto al volume indicato di buffer W2 concentrato sul flacone del reagente.
3. Posizionare la piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti in una piastra a pozzetto profondo da 96 pozzetti da 1,6 ml e centrifugare a 3 000 × g per 10 minuti.
4. Posizionare la piastra di preparazione del DNA a 96 pozzetti in una piastra inferiore pulita a forma di V a 96 pozzetti, aggiungere 25-30ul di acqua o elute al centro della membrana e lasciare riposare per 1 minuto a temperatura ambiente. Il DNA è stato eluito mediante centrifugazione a 3 000 x g per 5 minuti.
I produttori di tubi ottali PCR parlano di questioni che richiedono attenzione:
1. Riscaldare l'eluente o l'acqua a 65 ° C può aiutare a migliorare l'efficienza di eluizione.
2. Le molecole di DNA sono acide, si consiglia di conservare in 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,5 eluato.
