1. Recupero
●1. Togli il crioviale dall'azoto liquido, mettilo immediatamente in un bagno d'acqua a 37 gradi e agitalo leggermente. Dopo che il liquido si è sciolto (circa 1-1,5 minuti), estrailo e spruzza dell'alcool e mettilo sul banco da lavoro ultra pulito.
●2. Aspirare la suddetta sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml riempita con 10 ml di terreno (lavare la provetta di crioconservazione con terreno per eliminare tutte le cellule che aderiscono alla parete) e centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti.
●3. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di terreno per sospendere le cellule. Aspirato in una capsula di Petri da 10 cm contenente 10 ml di terreno di coltura e agitato delicatamente avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule nella capsula di Petri.
●4. Etichettare il tipo di cellula e la data, il nome del coltivatore, ecc., e metterlo in un incubatore a CO2 per la coltivazione. Dopo che le cellule aderiscono al muro, cambiare il mezzo.
●5. Cambia il mezzo ogni 3 giorni.
2. Passaggio
●1. Passaggio quando la copertura cellulare nella piastra di coltura raggiunge l'80 percento -90 percento .
●2. Aspirare il mezzo originale.
●3. Aggiungi la tripsina appropriata (quanto basta per coprire le cellule) e digerisci per 1-2 minuti.
●4. Dopo che le cellule sono state arrotondate, aggiungere un volume uguale di mezzo contenente siero per terminare la digestione.
●5. Utilizzare una pipetta per sospendere le cellule pipettando.
●6. Aspirare le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti.
●7. Eliminare il surnatante, aggiungere 1-2ml di terreno e far esplodere le cellule.
●8. Trasferire le cellule in diversi piatti a seconda del tipo di cella. In generale, ci sono 5 cellule tumorali e 3 cellule normali. Continua a coltivare.
3. Crioconservazione Digerire le cellule e centrifugare (ibid.). Sospendere le cellule con la soluzione di congelamento preparata e distribuirle in crioviali sterilizzati, lasciarle riposare per alcuni minuti e indicare il tipo di cellula e la data di crioconservazione. 4 gradi per 30 minuti, -20 gradi per 30 minuti, -80 gradi durante la notte, quindi collocati in azoto liquido per la conservazione. Preparazione della soluzione di crioconservazione: terreno completo al 70% più 20% di FBS più 10% di DMSO. Il DMSO dovrebbe essere aggiunto lentamente goccia a goccia, agitando mentre gocciola.
